實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對(duì)初始模板定量分析的問題。熒光定量PCR具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

熒光定量PCR原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)產(chǎn)物量的變化，末了得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

熒光定量PCR常用術(shù)語

1. 基線：實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的最初幾個(gè)循環(huán)中（一般為3-15個(gè)循環(huán)）的信號(hào)水平。此階段的熒光信號(hào)變化量極小。

2. 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光閾值默認(rèn)是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

3. Ct值：Ct值指的是PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。對(duì)已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做系列稀釋，對(duì)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行熒光定量PCR并記錄Ct值，根據(jù)Ct值及拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，橫坐標(biāo)代Ct值。

5. 實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量

6. 利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì)樣品的初始模板量進(jìn)行定量分析，需要利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值，最后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

7. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

8. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：設(shè)計(jì)特定引物，利用PCR對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后將目的基因片段克隆至載體中，測(cè)序驗(yàn)證是否為陽性重組質(zhì)粒，最后收集陽性克隆質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

9. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：測(cè)定質(zhì)粒的濃度，依據(jù)公式計(jì)算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，分別作為模板進(jìn)行熒光定量PCR并記錄Ct值。最后依據(jù)起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)及Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。當(dāng)需要對(duì)起始模板進(jìn)行定量時(shí)，只需要得到擴(kuò)增曲線，讀得Ct值，帶入標(biāo)準(zhǔn)方程即可對(duì)起始模板定量。

熒光標(biāo)記方法

熒光定量PCR熒光標(biāo)記方法可分為熒光染料法和熒光探針法兩類。

• 熒光染料：染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內(nèi)部的特性，來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。

• 熒光探針：探針為一段寡核苷酸，可與DNA序列特異性結(jié)合，一個(gè)模板結(jié)合一個(gè)探針。探針5’端具有報(bào)告基團(tuán)（R），可發(fā)光；3’端有熒光淬滅基團(tuán)（Q），能吸收光。探針完整時(shí)R基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，探針會(huì)被聚合酶水解，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的光沒有被淬滅基團(tuán)吸收，從而被儀器檢測(cè)到。

熒光探針與染料法對(duì)比

探針法：特異性高、重復(fù)性好，但只適合一個(gè)特定的目標(biāo)，探針價(jià)格較高。

染料法：對(duì)DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA，使用方便，成本低，但容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。

熒光定量PCR應(yīng)用

  實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域中。在科研方面可定量分析各種基因的表達(dá)分析，基因突變和多態(tài)性分析，單核苷酸多態(tài)SNP測(cè)定及易位基因的檢測(cè)；在醫(yī)學(xué)方面可用于免疫組化分析、早期篩查、病原體檢測(cè)、耐藥性分析、腫瘤微小殘留病變研究等。

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